服務(wù)簡介:
原代細(xì)胞(primaryculturecell)是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。
原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此,較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),如果是正常細(xì)胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實際上,通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。
動物組織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散,獲得單個細(xì)胞,再生長于培養(yǎng)皿中。大多數(shù)組織可以制備原代細(xì)胞,但生長的快慢及難易程度不一。腎和睪丸最常用,甲狀腺細(xì)胞生長較慢,只用于某些特定的病毒如豬傳染性腸胃炎病毒的培養(yǎng)。
原代細(xì)胞的分離方法:
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞。
二、實體組織材料的分離方法
對于實體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
(一)機械分散法
特點:簡便、快速,但對組織機械損傷大,而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織。
(二)消化分離法
組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動,使團(tuán)塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時再采用機械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個細(xì)胞的細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)后,細(xì)胞容易貼壁生長。
1、酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶
(1) 胰蛋白酶分散技術(shù)
胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應(yīng)用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產(chǎn)品的活力和純度不同,對細(xì)胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細(xì)胞的作用,取決于細(xì)胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等:
①細(xì)胞類型。胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結(jié)締組織較豐富的組織,如乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效,但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力。市售的胰蛋白酶,其活力都經(jīng)過測定而有效,但配制時必須新鮮,需保存在低溫冰箱中,消化時的pH和溫度都要適宜,否則會影響活力,細(xì)胞的分散直接與酶的活力有關(guān),最終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時活力最強。該酶為粉劑,保藏時要防潮,室內(nèi)溫度不宜過高,保存時間不能太長,若粉劑結(jié)團(tuán)塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度。胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時,濃度可適當(dāng)提高,消化時間適當(dāng)延長。濃度高對細(xì)胞有毒性,而較低濃度的胰蛋白酶在培養(yǎng)液中可促進(jìn)細(xì)胞的增殖,若培養(yǎng)液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度。一般認(rèn)為胰蛋白酶在56℃時活性最強,但由于對細(xì)胞有損害而不能被采用,常使用的溫度為37℃,通常在37℃進(jìn)行消化比室溫作用快。
⑤pH。 pH8-pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強分散快,細(xì)胞也容易被消化下來,消化分離細(xì)胞時PH只能選用7.6-8.0之間,否則對細(xì)胞有損傷。
⑥無機鹽。離子若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時,可以發(fā)生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時間。如果細(xì)胞消化時間過長,可以損害細(xì)胞的呼吸酶,從而影響細(xì)胞的代謝,一般消化時間為20分鐘為宜,冷消化時使用低濃度消化液,于4℃過夜也可。
分離方法如下:
①過夜冷消化將取得的組織用Hanks液洗三次,剪成碎塊大小為4毫米左右,用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織,再加入0.25%的胰蛋白酶,搖勻后放4℃過夜,次日再用Hanks液洗滌,棄去上清,共洗2-3次,然后,加入少量營養(yǎng)液吹打分散,細(xì)胞計數(shù),按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
②多次提取消化法多次提取消化法有以下三種:
熱消化多次提取--將剪碎的細(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15-20分鐘,然后經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液,按合適的濃度分瓶培養(yǎng),然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作,再消化提取細(xì)胞。
冷消化多次提取--方法同上,只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營養(yǎng)液分散,制成懸液,剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過夜,次日再提取細(xì)胞,分散成懸液,分瓶培養(yǎng)。
(2)膠原酶(Collagenase)消化法
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶,對膠原有很強的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,對細(xì)胞本身影響不大,可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡便又可提高細(xì)胞成活率,最終濃度200u/mL或0.1-0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無需機械振蕩,但膠原酶價格較高,大量使用將增加實驗成本。
經(jīng)過膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細(xì)胞對酶有耐受性,可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被完全消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個上皮細(xì)胞更易生長,因此不必要再進(jìn)一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時間(小時)有差異(見表4-2),以及兩者價格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時還可加透明質(zhì)酸酶(對細(xì)胞表面糖基有作用),采用兩者的聯(lián)合消化作用,對分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時所需時間(小時)(0.5-1cm3)
除上述兩種最常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年來,還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離。
3、消化分離法的操作步驟
(1)剪切把組織塊剪碎,呈1-5mm大小的組織塊。
(2) 加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。
(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時間(中間可輕搖1-2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。
(4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
(5)漂洗將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應(yīng),采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培養(yǎng)基。
(6)機械分散采用吸管吹打或振蕩法,使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng),若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
4.消化分離法的注意事項
(1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
(2)胰蛋白濃度不宜過高,作用時間不能太長,以避免毒性作用。
(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動作要輕,以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。
原代細(xì)胞的培養(yǎng)步驟
一、靜置貼壁細(xì)胞(包括半貼壁細(xì)胞的培養(yǎng))培養(yǎng)要求
1、細(xì)胞要通過充分漂洗,以盡量除去消化液的毒性;
2、細(xì)胞接種時濃度要稍大一些,至少為5×108細(xì)胞/L;
3、培養(yǎng)基可用Eagle(MEM)或DMEM培養(yǎng);
4、小牛血清濃度為10%-80%;
5、應(yīng)在37℃5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
6、在起始的2天中盡量減少振蕩,以防止剛貼壁的細(xì)胞發(fā)生脫落,漂??;
7、待細(xì)胞基本貼壁伸展并逐漸形成網(wǎng)狀,應(yīng)將原代細(xì)胞換液;
8、用骨髓或外周血中的懸浮細(xì)胞經(jīng)靜置培養(yǎng)1周時,應(yīng)將細(xì)胞懸液經(jīng)低速離心后換液。
二、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)要求
1、原代培養(yǎng)時要盡量去除紅細(xì)胞;
2、短期培養(yǎng),可在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行;
3、細(xì)胞濃度可在5-8×109/L范圍內(nèi)進(jìn)行分瓶試驗;
4、長期培養(yǎng)時,淋巴細(xì)胞中要加入生長因子,白血病細(xì)胞中要加入少量的原患者血清,以利細(xì)胞生長;
5、細(xì)胞換液一般每隔3天需半量換液一次;
6、細(xì)胞傳代一般待細(xì)胞增殖加快、細(xì)胞密度較高時才能進(jìn)行。
三、原代細(xì)胞的維持
1、貼壁細(xì)胞長成網(wǎng)狀或基本單層時,未達(dá)到飽和密度,需采取換液方式來更新營養(yǎng)成分以滿足細(xì)胞繼續(xù)生長繁殖的需要;
2、換入等量完全培養(yǎng)基或換成含2%小牛血清的維持液;
3、懸浮細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)基中不僅會發(fā)生轉(zhuǎn)化而且會發(fā)生分裂繁殖,此時培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分并不能維持細(xì)胞的營養(yǎng)需求,需進(jìn)行換液。通常采用半量換液的方法;
四、原代細(xì)胞培養(yǎng)的首次傳代
原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖,數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度;貼壁細(xì)胞的相互匯合,使整個瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋,細(xì)胞難以繼續(xù)生長繁殖,需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng),這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過程稱之為傳代。
首次傳代應(yīng)注意以下幾點:
(1)細(xì)胞生長密度不高時,不能急于傳代。
(2)原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時間。
(3)吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機械損傷。
(4)首次傳代時細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。
(5)首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%~20%左右。
五、其他培養(yǎng)法
(一)組織塊培養(yǎng)法
組織塊培養(yǎng)是常用、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中,瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長。
(二)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法
對于懸浮生長的細(xì)胞,如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無需消化,可采用低速離心分離,直接培養(yǎng),或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。
(三)器官培養(yǎng)
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后,不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng),器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性,可用于重點觀察細(xì)間的聯(lián)系、排列情況和相互影響,以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。
服務(wù)流程:
方案溝通 合同確認(rèn) 開始試驗 細(xì)胞株交付并反饋 實驗結(jié)束
如何下單:
1 . 郵件咨詢下單:填寫實驗項目的信息后,發(fā)送至郵箱[email protected]。
2 .在線咨詢下單:點擊屏幕右側(cè)“在線咨詢”,或掃描二維碼添加微信,或撥打咨詢電話15810756989,我們會盡快安排工作人員與您聯(lián)系!